Las enzimas (ó endonucleasas) de restricción son unas proteínas con acción catalítica que tienen la propiedad de reconocer secuencias cortas, de unos cuatro ó seis pares de bases en el ADN de doble hebra, y cortar en todos los puntos donde se encuentre dicha secuencia.
Este lugar de corte se denomina diana de restricción. Cada enzima de restricción tiene una diana particular en el ADN. En la actualidad hay un amplísimo catálogo de enzimas de restricción (podéis ver un ejemplo en el listado de Takara) y los usos destinados son varios: para la realización de mapas físicos (hablamos de ADN, no de cordilleras XDD), huella genética ó fingerprinting, búsqueda de polimorfismos tipo SNPs, AFLPs, RFPLs, utilización en pasos previos a la clonación…etc. Y multitud de aplicaciones más específicas que hacen muy versátiles en su uso.
Con un ejemplo queda todo más claro: una enzima muy típica es Alu I que reconoce la secuencia AGTC y corta la doble hélice del ADN entre la Guanina y la Timina. Su actuación sería darse un paseo por toda la hebra de ADN en búsqueda de esa diana. En el momento que la encuentra, se ancla y corta, obteniéndose dos fragmentos. Si no hubiera esa secuencia diana, no corta y el fragmento de ADN de doble cadena que teníamos quedará igual que antes. Si os dais cuenta, es un buen método para diferenciar individuos. La variación de nucleótidos entre distintos individuos puede observarse de esta forma sin necesidad de secuenciar.
No se aplican estas enzimas a la totalidad del ADN genómico, ya que se obtendrían multitud de bandas que no se podrían distinguir bien. Se amplifican, mediante PCR, ciertos lugares específicos del ADN para que las dianas de restricción permitan obtener unos resultados claros para su posterior análisis.
Para los que trabajamos en un laboratorio esto que acabo de explicar es como usar el cuchillo en las comidas, pero ya he visto que hay cierto interés en ciertas aplicaciones de uso en el laboratorio y pronto haré una review de herramientas que facilitan el estudio mediante enzimas de restricción.
Por ahora, para que no sea un rollo lo que he explicado, os dejo con un vídeo (es una animación en 3D) sobre como actúa una enzima de restricción para clonar un fragmento de ADN. Recordad lo que es la clonación. Es una de las técnicas de ingeniería genética más comunes en los laboratorios de biología molecular. Se puede ver como la actuación de la enzima proporciona unos extremos en el plásmido (son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico.
Están presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamaño varía desde 1 a 250 kb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula) que son complementarios al corte hecho a un fragmento de ADN que queremos insertar con la misma enzima de restricción. Por último serán unidos los extremos por otra enzima llamada ligasa. Así se puede incluir como si formara parte del plásmido y obtener copias idénticas del fragmento de interés al replicarse la bacteria.
Este lugar de corte se denomina diana de restricción. Cada enzima de restricción tiene una diana particular en el ADN. En la actualidad hay un amplísimo catálogo de enzimas de restricción (podéis ver un ejemplo en el listado de Takara) y los usos destinados son varios: para la realización de mapas físicos (hablamos de ADN, no de cordilleras XDD), huella genética ó fingerprinting, búsqueda de polimorfismos tipo SNPs, AFLPs, RFPLs, utilización en pasos previos a la clonación…etc. Y multitud de aplicaciones más específicas que hacen muy versátiles en su uso.
Con un ejemplo queda todo más claro: una enzima muy típica es Alu I que reconoce la secuencia AGTC y corta la doble hélice del ADN entre la Guanina y la Timina. Su actuación sería darse un paseo por toda la hebra de ADN en búsqueda de esa diana. En el momento que la encuentra, se ancla y corta, obteniéndose dos fragmentos. Si no hubiera esa secuencia diana, no corta y el fragmento de ADN de doble cadena que teníamos quedará igual que antes. Si os dais cuenta, es un buen método para diferenciar individuos. La variación de nucleótidos entre distintos individuos puede observarse de esta forma sin necesidad de secuenciar.
No se aplican estas enzimas a la totalidad del ADN genómico, ya que se obtendrían multitud de bandas que no se podrían distinguir bien. Se amplifican, mediante PCR, ciertos lugares específicos del ADN para que las dianas de restricción permitan obtener unos resultados claros para su posterior análisis.
Para los que trabajamos en un laboratorio esto que acabo de explicar es como usar el cuchillo en las comidas, pero ya he visto que hay cierto interés en ciertas aplicaciones de uso en el laboratorio y pronto haré una review de herramientas que facilitan el estudio mediante enzimas de restricción.
Por ahora, para que no sea un rollo lo que he explicado, os dejo con un vídeo (es una animación en 3D) sobre como actúa una enzima de restricción para clonar un fragmento de ADN. Recordad lo que es la clonación. Es una de las técnicas de ingeniería genética más comunes en los laboratorios de biología molecular. Se puede ver como la actuación de la enzima proporciona unos extremos en el plásmido (son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico.
Están presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamaño varía desde 1 a 250 kb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula) que son complementarios al corte hecho a un fragmento de ADN que queremos insertar con la misma enzima de restricción. Por último serán unidos los extremos por otra enzima llamada ligasa. Así se puede incluir como si formara parte del plásmido y obtener copias idénticas del fragmento de interés al replicarse la bacteria.
LA ADN LIGASA
La enzima, ADN ligasa, repara los millones de discontinuidades de ADN generadas durante la vida normal de la célula, por ejemplo, acoplando los abundantes fragmentos de ADN formados durante la copia del material genético en la división celular.
"Nuestro estudio muestra que la ADN ligasa cambia de una forma abierta, extendida, a una forma cerrada, circular, a medida que va uniendo las hebras del ADN", explica Tom Ellenberger, coautor del estudio, y director del Departamento de Bioquímica y Biofísica Molecular de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington en St. Louis.
El ADN es sorprendentemente reactivo bajo la embestida continua de toxinas ambientales y metabolitos celulares. La reparación del ADN dañado es vital para mantener la integridad del diseño genético.
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Cuando estos procesos de reparación se desequilibran, las células pueden funcionar mal, morir o volverse cancerosas, por lo que es muy importante saber cómo los "mecánicos del ADN" hacen su trabajo. Las ADN ligasas son blancos atractivos para la quimioterapia del cáncer y otras enfermedades.
La enzima opera coordinadamente con otra proteína de forma anular, conocida como Sliding Clamp (abrazadera deslizante). Las proteínas de este grupo, como por ejemplo la PCNA humana, actúan como reguladores maestros de la reparación de ADN, guiando a las enzimas correctoras al sitio dañado.
"Creemos que cuando la ligasa se acopla a la PCNA y rodea al ADN, se eyectan otras proteínas reparadoras desde la PCNA", explica Ellenberger. En este caso, la ligasa sería el inspector de calidad que certifica que el ADN está listo para el paso final de unir los extremos.
Para visualizar las complejas y dinámicas estructuras de la ADN ligasa y la PCNA, tanto individualmente como en asociación, Ellenberger y su grupo trabajaron en estrecha colaboración con científicos del Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley.
Los investigadores usaron una combinación de cristalografía de rayos X y dispersión de rayos X de pequeño ángulo (SAXS), valiéndose de un organismo modelo llamado Sulfolobus solfataricus que comparte muchas características bioquímicas de organismos multicelulares, incluyendo a los humanos.
Los resultados de esta investigación muestran por primera vez cómo se ensamblan dinámicamente estas proteínas y cambian su forma para unir los extremos del ADN durante la copia y reparación.
LOS PLÁSMIDOS
Un plásmido consiste en una cadena doble de ADN cerrada por sus extremos y que tiene por lo tanto forma circular. En otras palabras, un plásmido es ADN bicatenario circular, a diferencia del ADN celular que siendo bicatenario (dos hebras formando la archiconocida doble hélice), no está cerrado por sus extremos.
Los plásmidos son literalmente material genético accesorio. Se replican independientemente de los cromosomas y la información que contienen puede conferir a la célula que los alberga resistencia a antibióticos, capacidad para la degradación de compuestos aromáticos, fermentación de azúcares, etc.
El número de plásmidos presentes en una célula puede oscilar; así, algunas no contendrán ningún plásmido mientras que otras contendrán varias copias del mismo. Si el plásmido posee la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano se le denomina episoma. Dentro de este grupo de plásmidos se encuentran los factores de fertilidad o plásmidos F, que regulan el proceso de conjugación bacteriana.
El número de plásmidos presentes en una célula puede oscilar; así, algunas no contendrán ningún plásmido mientras que otras contendrán varias copias del mismo. Si el plásmido posee la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano se le denomina episoma. Dentro de este grupo de plásmidos se encuentran los factores de fertilidad o plásmidos F, que regulan el proceso de conjugación bacteriana.
Estas características de independencia de replicación y potencial inserción en el genoma celular convierte a los plásmidos en herramientas de ingeniería genética muy versátiles para producir ADN recombinante.
Los plásmidos bacterianos son los más usados, debido a lo fácil que resulta manipularlos en un tubo de ensayo. Para ello se utilizan las llamadas enzimas de restricción, que cortan el ADN del plásmido sólo en sitios determinados muy precisos. Algunas de esas enzimas cortan por secuencias de nucleótidos que facilitan la labor de ensamblaje con nuevos fragmentos de ADN que, previamente, han sido cortados con dicha enzima.
El paso final es soldar ambos fragmentos para obtener el plásmido recombinante, lo que se consigue con otras enzimas llamadas ligasas. Una vez obtenido el plásmido recombinante comienza el proceso de clonación. El primer paso es volver a introducir el plásmido en la bacteria, un proceso que se puede conseguir por ejemplo permeabilizando la membrana celular. El segundo paso es realizar un cultivo bacteriano para incrementar el número de bacterias que han incorporado el plásmido a su estructura.
El paso final es soldar ambos fragmentos para obtener el plásmido recombinante, lo que se consigue con otras enzimas llamadas ligasas. Una vez obtenido el plásmido recombinante comienza el proceso de clonación. El primer paso es volver a introducir el plásmido en la bacteria, un proceso que se puede conseguir por ejemplo permeabilizando la membrana celular. El segundo paso es realizar un cultivo bacteriano para incrementar el número de bacterias que han incorporado el plásmido a su estructura.
Los plásmidos poseen múltiples aplicaciones. Por ejemplo, se utilizan plásmidos con resistencia a los antibióticos para identificar aquellas colonias que contienen el plásmido deseado. Los usos que se den al ADN así clonado entran en el campo de la ingeniería genética.
SINTESIS DE PROTEINA
La síntesis de proteínas o traducción tiene lugar en los ribosomas del citoplasma celular. Los aminoácidos son transportados por el ARN de transferencia (ARNt) , específico para cada uno de ellos, y son llevados hasta el ARN mensajero (ARNm), dónde se aparean el codón de éste y el anticodón del ARN de transferencia, por complementariedad de bases, y de ésta forma se sitúan en la posición que les corresponde.
Una vez finalizada la síntesis de una proteína, el ARN mensajero queda libre y puede ser leído de nuevo. De hecho, es muy frecuente que antes de que finalice una proteínaya está comenzando otra, con lo cual, una misma molécula de ARN mensajero, está siendo utilizada por varios ribosomassimultáneamente.
- Los ARNt desempeñan un papel central en la síntesis de las proteínas
La síntesis de las proteínas comienza con la unión entre sí de dos aminoácidos y continúa por el agregado de nuevos aminoácidos -de a uno por vez- en uno extremos de la cadena.
Como se sabe la clave de la traducción reside en el código genético, compuesto por combinaciones de tres nucleótidos consecutivos -o tripletes- en el ARNm. Los distintos tripletes se relacionan específicamente con tipos de aminoácidos usados en la síntesis de las proteínas.
Cada triplete constituye un codón: existen en total 64 codones, 61 de los cuales sirven para cifrar aminoácidos y 3 para marcar el cese de la traducción. Tal cantidad deriva de una relación matemática simple: los cuatro nucleótidos (A, U, C y G)se combinan de a tres, por lo que pueden generarse 64 (43).
Dado que existen más codones, (61) que tipos de aminoácidos (20), casi todos pueden ser reconocidos por más de un codón, por lo que algunos tripletes a como "sinónimos". Solamente el triptófano y la metionina -dos de los aminoácidos menos frecuentes en las proteínas - son codificados, cada uno, por un solo codón
Generalmente los codones que representan a un mismo aminoácido se parecen entre sí y es frecuente que difieran sólo en el tercer nucleótido. La baja especificidad de este nucleótido ha llevado a decir que existe una "degeneración" en tercera base de la mayoría de los codones. Resta agregar que el número de codones en el ARNm determina la longitud de la proteína.
LA INSULINA HUMANA
La hormona insulina, involucrada en la regulación y metabolismo de la glucosa, fue hasta la década de los 80 obtenida de páncreas de cerdo o bovino. Fue a partir de 1982, cuando se introdujo en el mercado insulina humana producida por ingeniería genética, empleando como organismo productor la bacteria Escherichia coli. Actualmente se emplean además de E. coli otros microorganismos, tales como algunos tipos de levaduras.
Es de destacar que la insulina humana obtenida por ingeniería genética fue la primera molécula producida con fines terapéuticos que se introdujo en el mercado. Desde su introducción en el mercado, ha sustituido paulatinamente a la insulina obtenida de páncreas de cerdos y bovinos. En la década de los 90 la “insulina humana recombinante” representaba el 70% de la insulina disponible en el mercado, siendo actualmente el 93% de la insulina producida.
- La producción de “insulina recombinante” posee las ventajas de tener protocolos de producción más sencillos, con altos rendimientos de producto, por lo tanto, a medida que los mismos son introducidos en el mercado, dan como resultado una sensible reducción en los costos de los mismos. Las nuevas técnicas de ingeniería genética empleando plantas o animales transgénicos, permitirían aún mayores rendimientos de producción, sin necesidad de contar con grandes reactores de cultivo en el laboratorio. Estas nuevas tecnologías aplicadas a la producción en gran escala de insulina actualmente están en distintas fases de desarrollo y restan realizar en algunos casos pruebas de seguridad y eficacia del producto; pero de ser los resultados positivos, se estima que en poco tiempo, quizás en unos 3 años, puedan estar disponibles para el tratamiento de pacientes con diabetes 1 o diabetes tipo 2 con requerimientos de insulina.
Existen en el mundo cerca de 200 millones de personas que padecen diabetes y las proyecciones epidemiológicas dicen que esta cifra tenderá a duplicarse en los próximos quince años. La producción de insulina tiene una importante demanda en el mercado mundial alcanzando los 5000 millones de dólares.
Si tomamos el caso de Argentina, existen poco más de un millón y medio de pacientes diabéticos; con una demanda de insulina de 50 millones de dólares anuales. El tratamiento genera un gran impacto económico en los pacientes y en los sistemas de salud por tratarse de una terapia crónica con un producto de considerable valor.
Por tal motivo la posibilidad de producir insulina humana a través de bovinos transgénicos, obteniéndose a partir de leche vacuna, significará un cambio radical; ya que con sólo 25 vacas se obtendría los 200 kilos de insulina humana que se necesitan por año en la Argentina, y que actualmente se importan. En tal sentido, la empresa Bio Sidus ha apostado, al producir insulina en bovinos transgénicos, llegar a la comunidad con este nuevo desarrollo tendiente a disminuir los costos de producción, que según los expertos sería del 30 – 40%; conjuntamente con las ventajas que conlleva la independencia de productores extranjeros. Es de elogiar este nuevo avance de Bio Sidus, pues es la primera insulina humana recombinante en el mundo obtenida por bovinos transgénicos. Sólo hay 2 multinacionales que producen insulina humana empleando cabras transgénicas, purificándose la misma a través de la leche; y una empresa canadiense que obtiene insulina humana en plantas. Si bien estos desarrollos no están aún en el mercado, se estima que en poco tiempo estarán disponibles.
Es de destacar que este desarrollo científico-tecnológico posiciona a la empresa Bio Sidus, y a la Argentina a un nivel privilegiado en lo que respecta a nivel biotecnológico.
- Más allá de la inversión monetaria; que sin lugar a dudas fue muy importante, ya que se invirtieron 4 millones de dólares para la realización de este proyecto; así como el trabajo conjunto de más de 50 científicos; lo que se transluce es el sentido de visión estratégica, el alto compromiso, dedicación y profesionalidad que se ha apostado en el área biotecnológica en Argentina. En países como Argentina y Brasil, esta área ha adquirido un importante desarrollo, contando con carreras universitarias de grado y postgrados, con maestrías y doctorados específicos en el área, y con polos tecnológicos altamente desarrollados, con una fuerte y seria interrelación industria-academia. El hecho que la Argentina mediante la empresa Bio Sidus haya logrado este importante éxito, sumado a los que ya están puestos en marcha, así como otros emprendimientos vinculados a la producción de insulina humana mediante ingeniería genética, por distintos laboratorios argentinos, nos demuestran de la pujanza, dinamismo, capacidad emprendedora y compromiso que tiene este país en lo que a biotecnología respecta. Un verdadero ejemplo….
- LA REACCIONEN CADENA DE LA POLIMENASA
- La reacción en cadena de la polimerasa, ya más conocida como PCR, es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Uno de los aportes fundamentales de esta metodología a la investigación básica en biología molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requería largas y tediosas .
- El producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza- favorece la tarea de los investigadores empeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y función de los genes. Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide.
- Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna. Entre las aplicaciones médicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico. Permite detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Ha sido aplicada, por ejemplo, para diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recién nacidos de madres seropositivas, pues la existencia de anticuerpos maternos impide obtener resultados confiables, con los métodos convencionales, durante el primer año de vida. También ha facilitado el diagnóstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística, e hizo posible reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológ icas. Su sensibilidad permite detectar poblaciones residuales de células cancerosas en pacientes sometidos a quimioterapia y de este modo se ha podido determinar, con una antelación en extremo valiosa, un nuevo avance de la enfermedad. Existen ya modos de evaluar a través de la PCR el riesgo de padecer dolencias tales como diabetes de tipo I y la enfermedad celíaca. Precisamente los autores del presente trabajo y colaboradores han obtenido, mediante el empleo de esta técnica, resultados que indican la existencia de una vinculación entre determinadas variantes genéticasy dichas enfermedades en la población argentina. Los genes son porciones de ácido desoxirribonucleico (ADN) que tienen la información necesaria para la fabricación de los ácidos ribonucleicos (ARN) y, en última instancia, a través de éstos, de las proteínas: el ARN "copia" el mensaje contenido en el ADN y a partir de él da lugar a la correcta formación de la cadena o secuencia de aminoácidos que constituyen las proteínas. Todos los genes están compuestos por la misma materia prima: una sucesión de nucleótidos. Cada nucleótido está formado por un grupo fosfato, un azúcar con cinco carbonos (la desoxirribosa) y una de las siguientes bases nitrogenadas: adenina, timina, guanina o citosina. Los genes no se distinguen unos de otros por tener una composición fisicoquímica muy diferente, sino por el orden o secuencia en la que estas cuatro bases se disponen a lo largo de la molécula de ADN (véase "Somera descripción del ADN"). El hecho de que los genes no se distingan por su composición fisicoquímica hace prácticamente imposible aislarlos mediante el empleo de métodos bioquímicos de fraccionamiento del tipo de los usados para purificar proteínas como son, por ejemplo, la cromatografía, la electroforesis o la ultracentrifugación. Por otra parte, cada gen es una unidad de información sin solución de continuidad respecto del resto del ADN en el que está inmerso. Esto significa que a todo gen lo preceden y suceden otras secuencias de ADN que, en general, no tienen relación con él.
- El gen que codifica para la insulina, por ejemplo, tiene una "longitud" de 1.700 bases y su masa representa sólo la dos millonésima parte del ADN contenido en el núcleo de una célula humana... Hasta mediados de la década del ochenta, la única estrategia posible para aislar un gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular". Este método se basa en la introducción de fragmentos de ADN, uno de los cuales contendrá el gen de interés, en vectores. Éstos son moléculas de ADN (plásmidos o ADN de bacteriófagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como de multiplicarlos dentro de bacterias.
- Si se conoce un pequeño tramo de la secuencia de aminoácidos de una proteína cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar), se pueden diseñar métodos para identificar qué bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. Este reconocimiento también se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la proteína resultante del gen que se desea clonar. En este caso se reconoce la bacteria portadora porque fabrica la proteína codificada por el fragmento de interés, la cual se une específicamente al anticuerpo. Una vez aislado el gen no sólo resulta posible determinar con exactitud su secuencia de bases o analizar en detalle la información de la que es portador, sino que también se puede estudiar su expresión (la manera en que dirige la síntesis de la proteína correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares, introducido en células en cultivo o en animales de experimentación, etcétera. Estas técnicas, ya clásicas, han permitido el aislamiento y caracterización de decenas de miles de genes de microrganismos, animales y plantas, lo que provocó un cambio cualitativo en la comprensión del funcionamiento de la célula. En 1986, K. Mullis, un investigador de la Corporación Cetus, inventó un método para lograr la multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN sin necesidad de recurrir a los vectores y su replicación en bacterias. Este método revolucionaría en corto tiempo el conjunto de técnicas de la biología molecular. Su uso se extendió rápidamente a miles de laboratorios, no sólo de investigación básica, sino también de diagnóstico clínico. Se trata de la reacción en cadena de la polimerasa, ya muy conocida como PCR, siglas provenientes del inglés Polymerase Chain Reaction. LA TECNICA PCR Esta técnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el término que se ha impuesto) pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta más de dos mil nucleótidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas. Puede ser, por ejemplo, ADN nuclear total. El método se basa, en su forma más simple en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces (véase la figura 1). La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalización". En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucleótidos (oligonucleóridos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucleótidos, a los que se denomina "iniciadores" o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN molde. En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonucleósidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reacción. La temperatura a la que se realiza el tercer paso está condicionada por aquélla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers.
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- Para replicar el ADN, la técnica PCR hizo uso, en un principio, de la ADN polimerasa de la bacteria Escherichia coli. Pero esta enzima resulta desactivada debido a la alta temperatura requerida para desnaturalizarla doble cadena del ADN, por lo cual debía agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. Este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplazó por su equivalente de la bacteria "termófila" Thermus aquaticus. En efecto, la ADN polimerasa de este microrganismo, denominada Taq polimerasa, actúa eficientemente entre los 75° C y los 80° C y resiste más de dos horas a 93° C. De esta manera es posible mezclar todos los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo y la reacción en cadena puede llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizarán los ciclos térmicos programados. Estos equipos son provistos por numerosas empresas extranjeras, pero ya ha sido fabricado uno por la industria argentina. Todo esto no hace más que confirmar la creciente popularidad de la PCR entre investigadores, médicos y bioquímicos clínicos. Una vez finalizada la reacción se habrá logrado fabricar, en pocas horas, gran cantidad de un fragmento génico con un alto grado de pureza. Obtener el mismo resultado utilizando las técnicas clásicas de clonado llevaría varios días de tedioso trabajo. Por otra parte, la técnica PCR es el método de detección de secuencias de ADN más sensible conocido hasta la fecha: mediante ella resulta posible identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Es, por lo tanto, un instrumento extremadamente valioso para establecer, por ejemplo, lazos de parentesco (véase "Filiación").
- LOS TRANGÉNICOS
- Los organismos manipulados genéticamente (OMG) también llamados “transgénicos” son organismos nuevos creados en laboratorio, cuyas características se han alterado mediante la inserción de genes de otras especies. Por ejemplo, se inserta el gen de resistencia al frío del salmón en papa para buscarle resistencia a heladas, o genes de bacterias en maíz para darle resistencia a ciertas plagas.
much - RIEGOS DE LOS TRANGENICOS
Muchas discusiones se han entablado en torno a los transgénicos a nivel mundial. La pregunta de fondo siempre será ¿cómo afectan los alimentos transgénicos a los humanos?; además, si los cultivos transgénicos son utilizados para alimentar ganado u otros animales quedan algunas dudas acerca de la seguridad del consumo de carne de dichos animales. El Dr. Rubens Onofre, PhD en genética , y profesor de postgrado en recursos genéticos vegetales en la Universidad de Santa Catarina en Brasil, presentó en el 2009 el informe “Calidad de los análisis de riesgo e inseguridad de los transgénicos para la salud ambiental y humana”, documento del cual extraemos un resumen para detallar solo los riesgos para la salud humana. Aún no se han publicado estudios de largo plazo que garanticen que los productos transgénicos no causan daño a la salud humana, y tampoco se han realizado estudios rigurosos para determinar si existen posibles riesgos toxicológicos, sin embargo algunos países ya utilizan alimentos transgénicos. De acuerdo a Rubens, los estudios presentados por los impulsores de los transgénicos son, en general, de “calidad muy baja y por eso, difícilmente serían publicados en revistas de prestigio”. Entre las falencias que se detectan habitualmente están el bajo número de repeticiones y la corta duración de los ensayos.
La ausencia de estudios de largo plazo se hace extraña en la actualidad, considerando que los científicos trabajan con organismos genéticamente modificados (OGM) hace a varias décadas, y de acuerdo a lo que revela Rubens, en 1975 los investigadores se reunieron en California para discutir estrategias para “la contención física y biológica de las moléculas y vectores o los mismos organismos intervenidos”. Una medida de precaución que no se mantiene en nuestros días por la presión comercial.
De acuerdo al investigador, una segunda reunión realizada en el año 2000 tuvo mayor énfasis en criterios comerciales y poco interés en cubrir temas relacionados a la salud. De acuerdo a Rubens, las empresas productoras de semillas transgénicas ingresaron a la bolsa de valores para captar capital y esta estrategia “obliga a una empresa a presentar siempre resultados positivos. Como esto no siempre es posible, no se descarta la posibilidad de conflictos de interés en el desarrollo de investigaciones o productos.” La amenaza oculta La estrategia aplicada por la industria dedicada al desarrollo de transgénicos, fue similar a la que utilizaron las empresas financieras durante la última crisis global. Simplemente se logró disfrazar una actividad que implica alto riesgo, con un nombre que elimine la percepción de amenaza. Fue así que el término utilizado en los 70 y 80 orientado al manejo de “biorriesgos” fue reemplazado por estrategias para obtener “productos bioseguros”. A pesar de ser una industria con muchos años en actividad, se ha procurado evadir los estudios de largo plazo. Esta estrategia se ha concretado al establecer el criterio de equivalencia substancial en vez de realizar la evaluación de riesgos. Bajo el criterio de equivalencia substancial, si un OGM posee una composición de proteínas, carbohidratos, grasas, ceniza, aminoácidos, etc.. similar a los que presenta su contraparte que no ha sido modificada genéticamente, entonces el producto transgénico puede ser considerado seguro. Además, si se encuentran valores discrepantes, se utilizan valores similares de otras variedades de la misma especie para asegurar que el OGM es seguro. Rubens asegura que es necesario someter a los OGM a estudios de largo plazo, porque desde el punto de vista científico “ el transgene insertado en una planta contiene elementos bastante distintos de los encontrados en la planta original” y puede desencadenar efectos no previstos y colaterales. Por esto se requeriría establecer análisis toxicológicos en humanos, animales y medir el impacto en organismos no blanco. Se hace necesario evaluar “la estabilidad genética, alteraciones genómicas, toxicidad y alergenicidad, productos de la expresión génica, digestibilidad y metabolismo, biodisponibilidad de nutrientes y micronutrientes, toxicidad aguda y crónica, formulación y ensayo de alimentos para animales, posibles impactos a organismos no blanco, necesidad de información para el consumidor, entre otros”, indica el investigador. La falta de estudios solo refuerza la incertidumbre y debería llevar a la aplicación del principio precautorio.
Estados Unidos, Brasil, Argentina y Canadá son algunos de los países que no han adoptado el principio precautorio, y asumen que los transgénicos no ofrecen riesgos para la salud humana. Riesgos para la salud Rubens asegura que a la mayoría de plantas transgénicas se les ha insertado genes de resistencia a antibióticos, y diversos estudios confirman que procesos como la recombinación o la transferencia horizontal pueden trasladar esos genes a bacterias patógenas en humanos, de modo que la diseminación de transgénicos disminuiría la posibilidad de controlar enfermedades. Debido a la falta de estudios la Brithish Medical Association ha sugerido la prohibición de los genes de resistencia a antibióticos, la moratoria de plantaciones comerciales y establecer mejores mecanismos de vigilancia sanitaria. No existen estudios en humanos, pero ya se han presentado accidentes en los que maíz BT Starlink fue liberado para consumo animal, pero un grupo de personas “manifestaron reacciones alérgicas probablemente causadas por el consumo de derivados de ese maíz”. Este tipo de maíz posee el gen Cry9C, cuya toxina puede causar reacciones alérgicas en el hombre. De acuerdo al informe de Rubens, el investigador Arpad Pusztai “ constató que las ratas alimentadas con papas transgénicas presentaban cerebros, hígados y testículos menos desarrollados que el grupo de ratas control. Además, el estudio revelo una proliferación e hiperirritabilidad del sistema inmunológico de la mucosa del estómago de ratas alimentadas con papas transgénicas”. Hay efectos indirectos asociados al uso de soya transgénica, como el incremento en el uso de herbicidas y el aumento de residuos de glifosato por encima de las 10ppm. Rubens indica que estos contaminantes están asociados al desarrollo de cáncer, disturbios reproductivos en mamíferos, efecto desregulador del sistema endocrino o disrupción endocrina. No se puede afirmar que solo con la prohibición de la comercialización para consumo humano se pueda evitar el impacto sobre la salud de los consumidores. En Perú y México no ha sido autorizada la siembra de plantas transgénicas, y sin embargo han aparecido cultivos en los que se filtran plantas transgénicas. Muchas discusiones se han entablado en torno a los transgénicos a nivel mundial. La pregunta de fondo siempre será ¿cómo afectan los alimentos transgénicos a los humanos?; además, si los cultivos transgénicos son utilizados para alimentar ganado u otros animales quedan algunas dudas acerca de la seguridad del consumo de carne de dichos animales. El Dr. Rubens Onofre, PhD en genética , y profesor de postgrado en recursos genéticos vegetales en la Universidad de Santa Catarina en Brasil, presentó en el 2009 el informe “Calidad de los análisis de riesgo e inseguridad de los transgénicos para la salud ambiental y humana”, documento del cual extraemos un resumen para detallar solo los riesgos para la salud humana. Aún no se han publicado estudios de largo plazo que garanticen que los productos transgénicos no causan daño a la salud humana, y tampoco se han realizado estudios rigurosos para determinar si existen posibles riesgos toxicológicos, sin embargo algunos países ya utilizan alimentos transgénicos. De acuerdo a Rubens, los estudios presentados por los impulsores de los transgénicos son, en general, de “calidad muy baja y por eso, difícilmente serían publicados en revistas de prestigio”. Entre las falencias que se detectan habitualmente están el bajo número de repeticiones y la corta duración de los ensayos. La ausencia de estudios de largo plazo se hace extraña en la actualidad, considerando que los científicos trabajan con organismos genéticamente modificados (OGM) hace a varias décadas, y de acuerdo a lo que revela Rubens, en 1975 los investigadores se reunieron en California para discutir estrategias para “la contención física y biológica de las moléculas y vectores o los mismos organismos intervenidos”. Una medida de precaución que no se mantiene en nuestros días por la presión comercial. De acuerdo al investigador, una segunda reunión realizada en el año 2000 tuvo mayor énfasis en criterios comerciales y poco interés en cubrir temas relacionados a la salud. De acuerdo a Rubens, las empresas productoras de semillas transgénicas ingresaron a la bolsa de valores para captar capital y esta estrategia “obliga a una empresa a presentar siempre resultados positivos. Como esto no siempre es posible, no se descarta la posibilidad de conflictos de interés en el desarrollo de investigaciones o productos.” La amenaza oculta La estrategia aplicada por la industria dedicada al desarrollo de transgénicos, fue similar a la que utilizaron las empresas financieras durante la última crisis global. Simplemente se logró disfrazar una actividad que implica alto riesgo, con un nombre que elimine la percepción de amenaza. Fue así que el término utilizado en los 70 y 80 orientado al manejo de “biorriesgos” fue reemplazado por estrategias para obtener “productos bioseguros”. A pesar de ser una industria con muchos años en actividad, se ha procurado evadir los estudios de largo plazo. Esta estrategia se ha concretado al establecer el criterio de equivalencia substancial en vez de realizar la evaluación de riesgos. Bajo el criterio de equivalencia substancial, si un OGM posee una composición de proteínas, carbohidratos, grasas, ceniza, aminoácidos, etc.. similar a los que presenta su contraparte que no ha sido modificada genéticamente, entonces el producto transgénico puede ser considerado seguro. Además, si se encuentran valores discrepantes, se utilizan valores similares de otras variedades de la misma especie para asegurar que el OGM es seguro. Rubens asegura que es necesario someter a los OGM a estudios de largo plazo, porque desde el punto de vista científico “ el transgene insertado en una planta contiene elementos bastante distintos de los encontrados en la planta original” y puede desencadenar efectos no previstos y colaterales. Por esto se requeriría establecer análisis toxicológicos en humanos, animales y medir el impacto en organismos no blanco. Se hace necesario evaluar “la estabilidad genética, alteraciones genómicas, toxicidad y alergenicidad, productos de la expresión génica, digestibilidad y metabolismo, biodisponibilidad de nutrientes y micronutrientes, toxicidad aguda y crónica, formulación y ensayo de alimentos para animales, posibles impactos a organismos no blanco, necesidad de información para el consumidor, entre otros”, indica el investigador. La falta de estudios solo refuerza la incertidumbre y debería llevar a la aplicación del principio precautorio. Estados Unidos, Brasil, Argentina y Canadá son algunos de los países que no han adoptado el principio precautorio, y asumen que los transgénicos no ofrecen riesgos para la salud humana. Riesgos para la salud Rubens asegura que a la mayoría de plantas transgénicas se les ha insertado genes de resistencia a antibióticos, y diversos estudios confirman que procesos como la recombinación o la transferencia horizontal pueden trasladar esos genes a bacterias patógenas en humanos, de modo que la diseminación de transgénicos disminuiría la posibilidad de controlar enfermedades. Debido a la falta de estudios la Brithish Medical Association ha sugerido la prohibición de los genes de resistencia a antibióticos, la moratoria de plantaciones comerciales y establecer mejores mecanismos de vigilancia sanitaria. No existen estudios en humanos, pero ya se han presentado accidentes en los que maíz BT Starlink fue liberado para consumo animal, pero un grupo de personas “manifestaron reacciones alérgicas probablemente causadas por el consumo de derivados de ese maíz”. Este tipo de maíz posee el gen Cry9C, cuya toxina puede causar reacciones alérgicas en el hombre. De acuerdo al informe de Rubens, el investigador Arpad Pusztai “ constató que las ratas alimentadas con papas transgénicas presentaban cerebros, hígados y testículos menos desarrollados que el grupo de ratas control. Además, el estudio revelo una proliferación e hiperirritabilidad del sistema inmunológico de la mucosa del estómago de ratas alimentadas con papas transgénicas”. Hay efectos indirectos asociados al uso de soya transgénica, como el incremento en el uso de herbicidas y el aumento de residuos de glifosato por encima de las 10ppm. Rubens indica que estos contaminantes están asociados al desarrollo de cáncer, disturbios reproductivos en mamíferos, efecto desregulador del sistema endocrino o disrupción endocrina. No se puede afirmar que solo con la prohibición de la comercialización para consumo humano se pueda evitar el impacto sobre la salud de los consumidores. En Perú y México no ha sido autorizada la siembra de plantas transgénicas, y sin embargo han aparecido cultivos en los que se filtran plantas transgénicas- .
